ネオスポーラのELISAによる抗体検出法の開発

• 担当機関: （独）農業技術研究機構 動物衛生研究所
• 研究期間: 1999～2000
• 研究担当者: 衛藤真理子; 山根逸郎; 志村亀夫; 芝原友幸; 小岩井正博; 清水眞也; 猪島康雄; 播谷 亮; 國保健浩; 濱岡隆文
• 発行年度: 2001
• 要約: 簡便で非特異反応のほとんど認められず蛍光抗体法との結果の一致率が高くすべての哺乳類のネオスポーラ感染を検査できるELISAを開発した。
• 要約(英語): 19. Protein AG ELISA for detecting antibodies against Neospora caninum; The ELISA system consists of a N. caninum tachyzoite antigen treated with Triton X-100, chicken immunoglobulin and a milk-derived protein block, and peroxidase (POD)-labeled Protein AG conjugate. Non-specific reactions in indirect fluorescent antibody test (IFAT)-negative sera with the use of POD-labeled anti-bovine IgG significantly decreased with the use of POD-labeled Protein AG. There was no overlap of ELISA values for negative and positive gold standard sera in the gold standard panel. Anti-sera against Sarcocystis cruzi, Hammondia hammondi, Toxoplasma gondii, and Besnoitia wallacei failed to show a positive reaction in Protein AG ELISA (PAG-ELISA). ELISA values highly correlated with the log-transformed IFA titer (correlation coefficient =0.866, index of linearity =0.979). In the field samples, IFAT-negative sera showed ELISA values of 0.156±0.017 (mean±95% confidence interval), and IFAT-positive sera showed ELISA values of 0.697±0034. The negative and positive sera were significantly different from each other (p<0.0001). A cut-off ELISA value, resulting in the lowest total number of diagnostic errors and the response operation characteristic (ROC) curve, was 0.360. This cut-off value yielded 0.885 of kappa values, a 92.4% of sensitivity and a 96.5% of specificity. Thus, PAG-ELISA is simple, stable, specific, sensitive, and objective. PAG-ELISA is well suited to epidemiological surveys, other large tests of N. caninum infection, or the detection of latent infection by N. caninum. Furthermore, Protein AG reacts to almost all mammalian immunoglobulin, eliminating the need for specific anti-immunoglobulin antibodies. (Immunopathology Section, Department of Immunology TEL [phone])
• キーワード: ネオスポーラ，ELISA，死流産
• 背景・ねらい: ネオスポーラ(Neospora caninum;以下N.c.)は1988年に確認された新種の原虫で，多くの哺乳動物で感染が確認されている。ウシにおける感染は死流産を引き起こす。ウシでは胎盤感染するため; ，感染母牛の摘発は，感染を防御する手段として重要である。本疾病の血清診断法の標準法となっている間接蛍光抗体法(IFA)に代わる「簡便・高感度・短時間で検体を多数処理することのできるELISA」の開発が望まれている。現在までに; ，報告されているN.c.のELISAは『陰性血清が擬陽性を示す例が多く陽性反応と明瞭に区別することができず，カットオフ値を設定することは困難である』，『IFAとELISAの結果の一致性が悪い』; ，『特異性が高いELISAでは操作が煩雑になる』等の問題点があった。簡便で非特異反応がほとんど認められず，蛍光抗体法との一致率の高いN.c.のELISAの開発が望まれている。
• 成果の内容・特徴: 1.; ELISAは以下の通りである：培養N.c. JPA1株タキゾイトの精製抗原をTriton x-100で可溶化後，プレ－トに固定後，ニワトリ血清とブロッキング剤でブロッキングし; ，希釈した検査血清を反応後，POD標識r-protein AG (PAG, Prozyme) を反応させ，ABTS発色液を分注し発色させ，5% SDS溶液で反応を停止後; ，吸光度を求めた。; 2.; 陰性血清での有意な吸光度の低下が認められ (p0.01) ，陽性血清ではOD値が上昇する傾向が認められた(図1)。この結果; ，陰性陽性が明瞭に区別された。; 3.; ウシ野外例によりカットオフ値は0.36 ELISA 値で蛍光抗体価との陽性・陰性の判定結果と有意に一致していた (κ=0.885)(図2)。; 4.; 蛍光抗体価とELISA値は正によく相関していた (correlation coefficient =0.866, index of linearity =0.979)。(図3); 5.; ネオスポーラ関連の原虫に対する交叉反応はほとんど認められなかった(表1)。
• 成果の活用面・留意点: 1.; 信頼性と実用性が高いN.c.のELISAが開発された。; 2.; 本法を用いることにより，哺乳類のネオスポーラ感染を調査することが可能である。
• カテゴリ: 鶏