B型レスポンスレギュレータに固有なMyb様モチーフの構造と機能

• 担当機関: （独）農業生物資源研究所
• 研究期間: 1999～2003
• 研究担当者: 〔水野猛; 加藤悦子; 今村綾; 細田和男; 山崎俊正; 山田寿美（名大農）〕; 八田知久; 立木まり
• 発行年度: 2002
• 要約: BモチーフはHis-Asp情報伝達系B型レスポンスレギュレータに固有な構造モチーフであるが、その機能は不明であった。本研究では、BモチーフのNMR構造解析と機能解析を行い、BモチーフはB型レスポンスレギュレータのDNA結合機能と核移行機能を司るマルチ機能ドメインであることを明らかにするとともに、DNA認識機構を解明した。
• キーワード: His-Aspリン酸リレー、レスポンスレギュレータ、Bモチーフ／GARPモチーフ、タンパク質－DNA相互作用、NMR
• 背景・ねらい: ゲノムプロジェクトの進展により膨大な数の機能未知タンパク質が存在することが明らかにされた。これらの機能未知タンパク質の構造と機能の相関を解明することは、新機能物質の分子設計や生体機能制御等のバイオテクノロジー分野に大きく道を開くと期待される。本研究は、タンパク質の機能が立体構造と分子運動性により精緻に制御されていることに着目して、NMR解析から得られる立体構造情報、運動性情報、トポケミストリー情報を有機的に用い、高精度かつ迅速にタンパク質機能を予測・特定する新しい方法論の開発・確立を目指すものである。本研究の一環として、シロイヌナズナのHis-Asp情報伝達系B型レスポンスレギュレータ（ARR）に固有な機能未知Bモチーフ（ARR10-B）についてNMR動的構造解析と機能解析を行い、機能の特定と分子認識機構を解明した。

成果の内容・特徴

1. NMR法により決定したARR10-B単体の立体構造（図1）に基づき、ARR10-BはB型ARRのヘリックス・ターン・ヘリックス（HTH）型DNA結合ドメインであると推定した。
2. PCR-assisted DNA binding site selection法、gel retardation assay法、表面プラズモン共鳴法を併用して、ARR10-Bが塩基配列特異的にDNAと結合することを実証し、最適な認識配列がAGATTであることを明らかにした。
3. GFP-APP10-B fusionタンパク質の細胞内局在性を解析し、ARR10-Bには核移行シグナルが存在することを明らかにした。
4. ARR10-B/DNA複合体についてNMR滴定実験（図2）と分子間NOE解析を行い、ARR10-BのDNA認識機構を解明した。ARR10-BはHTH構造中のα3ヘリックスがmajor grooveを、N端のflexible armがminor grooveを認識してDNAと複合体を形成する（図3）。これは、ホメオドメインのDNA認識様式と類似している。

成果の活用面・留意点

1. BモチーフはB型レスポンスレギュレータのDNA結合機能と核移行機能を司るマルチ機能ドメインである。 　2．Bモチーフと相同性の高いモチーフは植物に特有なGARP転写因子群にも見い出されており（GARPモチーフ）、本研究の成果はGARP転写因子についても適用できると考えられる。