エレクトロポレーション法で導入した遺伝子の核への組込まれ様式

• 担当機関: 愛媛県農業試験場
• 研究期間: 1995～1999
• 研究担当者: 栗坂信之（愛媛県農業試験場）; 高岩文雄（農林水産省農業生物資源研究所）
• 発行年度: 1999
• 要約: エレクトロポレーション法で作出したイネの組換え体について、導入したＤＮＡをＰＣＲ法で解析することにより検出部位ごとの出現頻度が算出できる。導入ＤＮＡの各部位の出現頻度の分布が選択マーカ遺伝子を中心に二項分布に近似していることから、形質転換体の核内に組込まれた導入ＤＮＡは無作為に切断されている可能性がある。
• 背景・ねらい: 植物の遺伝子組換え法のうちアグロバクテリウム法では、植物細胞核への遺伝子の組込まれ様式が明らかになることにより、構築する遺伝子の目的遺伝子と選択マーカ遺伝子の並び順が改善され、遺伝子組換え体の作出効率が向上している。一方、エレクトロポレーション法など直接遺伝子導入法では、導入遺伝子が植物核に組込まれる様式は明らかにされていない。; 目的遺伝子にダイズ・グリシニン遺伝子また選択マーカ遺伝子にビアラフォス剤抵抗性遺伝子をタンデムにつないだｐＵＣ18プラスミドをエレクトロポレーション法でイネに導入した。形質転換イネについて、導入したプラスミドの全長を10か所の部位に分けＰＣＲ法で解析し、各部位の出現頻度から形質転換体の核における導入遺伝子の組込まれ様式を検討した。

成果の内容・特徴

1. 形質転換イネの葉より簡使法で抽出したＤＮＡをＰＣＲ法で解析することにより、導入ＤＮＡを検出し、どの部分が導入されているか解析できる。
2. 形質転換イネでは選択マーカ遺伝子の部位（フラグメントＶ）の出現頻度が約95％と最も高い（図1、2）。
3. 選択マーカ遺伝子の部位（Ｖ）から約1.7ｋｂｐ離れた目的遺伝子の部位（Ｖ皿）の出現頻度は、約45％と、約半分に減少する（図1、2）。
4. 導入ＤＮＡの各部位の出現頻度はフラグメントＶを中心にほぼ左右対称に減少し、二項分布に近似した分布を示す（図2）。
5. ＤＮＡを直接導入するエレクトロポレーション法では核内に導入されたＤＮＡは、無作為に切断され、短くなっている可能性がある（図2）。
6. エレクトロポレーション法で目的遺伝子と選択マーカ遺伝子をタンデムにつなで導入する場合、導入効率を向上するためには両遺伝子間をできるだけ短く構築する必要がある。

成果の活用面・留意点

1. エレクトロポレーション法でに供試する導入遺伝子の構築に利用できる。
2. エレクトロポレーション法で遺伝子導入した形質転換体の遺伝子解析に活用できる。

• カテゴリ: 大豆 抵抗性遺伝子