抗ペプチド抗体を用いる主要な小麦α-アミラーゼインヒビターの検出法

• 担当機関: （独）農業・食品産業技術総合研究機構 東北農業研究センター
• 研究期間: 2006～2010
• 研究担当者: 老田 茂
• 発行年度: 2010
• 要約: 小麦アレルゲンの一種である小麦α-アミラーゼインヒビターについて、エピトープを含む部分ペプチドに対する抗体を作製することにより、種類が異なるα-アミラーゼインヒビターやそのエピトープを検出できる。
• キーワード: アレルギー、酵素免疫測定、イムノブロッティング、エピトープ、コムギ
• 背景・ねらい: 小麦アレルゲンタンパク質の一種であるα-アミラーゼインヒビター(α-AI)には、分子量が13～15kDaのサブユニットで構成される単量体、二量体、四量体があり、それぞれアミノ酸配列が異なるため、小麦アレルギー患者により、反応するα-AIの種類が異なることが知られている。一方、単量体や二量体の小麦α-AIには、唾液や膵液のα-アミラーゼを阻害することから、血糖値上昇抑制効果が期待されている。しかし、種類が異なるα-AIの分別定量は容易でなく、さらにα-AIのエピトープ(ヒトIgE抗体が結合する部位)を検出する方法も未だないため、α-AIのアレルギー・代謝研究は進んでいない。; そこで、小麦α-AIのエピトープを含み、かつアミノ酸配列が異なる箇所のペプチドを複数合成して、それに対する抗体を作製することにより、単量体と二量体の小麦α-AIやそのエピトープ、および四量体の小麦α-AIを別々に検出する方法を開発する。

成果の内容・特徴

1. 単量体(0.28型)および二量体(0.19型、0.53型)の小麦α-AIのエピトープであるAVLRDCを含む13-merの抗原ペプチドNGSQVPEAVLRDCを合成し、キャリアタンパク質に結合後、ウサギに投与することにより、抗0.19型抗体が得られる。同様に、四量体小麦α-AIのうち、主要なアレルゲンであるCM16の15-mer部分ペプチドCRIETPGSPYLAKQQから、抗CM16抗体が得られる(表1)。
2. 抗0.19型抗体は単量体と二量体のα-AIに結合するが、四量体のCM16には結合せず、抗CM16は単量体と二量体のα-AIには結合しない(表1)。
3. 抗体を用いるイムノブロッテイング法(図)や酵素免疫測定法(エライザ)により、異なる品種・系統の小麦種子に含まれるα-AI量を比較できる。
4. 小麦α-AIがプロテアーゼによって分解されても、そのエピトープが未分解の場合は、アレルギー反応性が残る。抗0.19型抗体は、単量体・二量体α-AIエピトープのみのペプチドAVLRDCにも結合するため、エピトープの分解を酵素免疫測定法で確認できる(表2)。

成果の活用面・留意点

1. 本抗体の検査法を用いることにより、α-AI含有量が少ない、または逆にα-AI含有量が多い小麦品種・系統のスクリーニングに活用できる。
2. 本抗体を用いることにより、純度が高い単量体・二量体α-AIやCM16の調製が容易になる。
3. 消化管内におけるα-AIやそのエピトープの分解過程の解析が可能になるため、α-AIのアレルギー・代謝研究に活用できる。

• カテゴリ: 小麦 品種