LAMP法によるニホンナシ自家和合性個体の選抜

タイトル	LAMP法によるニホンナシ自家和合性個体の選抜
担当機関	（独）農業・食品産業技術総合研究機構果樹研究所
研究期間	2010～2013
研究担当者	寺上伸吾奈島賢児國久美由紀西谷千佳子齋藤寿広山本俊哉
発行年度	2013
要約	開発したLAMPプライマーセットによって、簡便、迅速かつ高額機器を必要とせずにニホンナシS ハプロタイプが判定できることから、S₄^smハプロタイプを有する自家和合性個体の迅速な選抜が可能となる。
キーワード	ニホンナシ、自家和合性、LAMP法、DNAマーカー選抜
背景・ねらい	ニホンナシは配偶体型の自家不和合性を示すことから、自家受精しない。しかしながら、ニホンナシ「二十世紀」の枝変わりである「おさ二十世紀」は、S₄-RNaseを含む236kbpのゲノム領域が欠損したS₄^smハプロタイプを持ち、自家和合性を示す。「おさ二十世紀」由来のS₄^smハプロタイプを持つ個体は、安定した自家結実性を示すことが示されており、近年の気候変動に起因する開花期の長雨や低温による結実不安定の解消、および年間総労働時間の約10%を占める手作業による授粉作業の省力化が期待される。ニホンナシS ハプロタイプの判定にはPCR-RFLP法が用いられてきたが、PCR-RFLP法は、高いコスト、煩雑な操作、検出時間の長さ、高額機器が必要などの問題があり、育種現場で利用できる簡便な技術開発が求められている。迅速、簡便で低コストのDNAマーカー検出手法として、Loop-Mediated Isothermal Amplification(LAMP)法が知られている。そこで、LAMP法によるS₄^smハプロタイプを有する自家和合性個体および、ニホンナシS ハプロタイプ(S1_-9、S_kおよびS₄^sm)の判定方法を開発する。
成果の内容・特徴	S₄^smハプロタイプ特異的に設計したLAMPプライマー(表1)は、S₄^smハプロタイプを持つ個体のみで増幅を示し、他のSハプロタイプでは増幅を示さないことから、「おさ二十世紀」由来自家和合性個体の選抜マーカーとして利用可能である。 S₁、S₂、S₄、S₆、S₇、S₈、S₉-RNaseの公開配列から設計したLAMPプライマーは、各S-RNaseを特異的に検出する。S₃-RNaseおよびS₅-RNaseは配列の相同性が極めて高いため、今回設計したLAMPプライマーでは両S-RNaseを区別することはできない。反応液に蛍光・目視検出試薬(栄研化学株式会社)を混合し、63°Cで60分間のインキュベートによりLAMP反応を進行させた後、目視での検出が可能である(図1)。LAMP法を用いることにより、従来法と同等の検出感度で、60分でSハプロタイプの判定が可能である(図2)。
成果の活用面・留意点	プライマー設計に用いた10種類のS-RNase(S_1-9、Sk)およびS₄^smハプロタイプの塩基配列は、公共の遺伝子データベースに登録されている。今回開発した各Sハプロタイプを検出するLAMPプライマーセットは、論文中(奈島ら、2014)で公表している。 S_k-RNase増幅用のプライマーでは、S₄-RNaseを有する個体でも増幅が認められたことから、S_k-RNaseおよびS₄-RNaseを認識すると考えられる。「おさ二十世紀」由来S₄^smハプロタイプを有していても、S₄S₄^smとS₁S₄^sm遺伝子型の個体は自家不和合性を示す。 LAMP反応に用いる恒温槽には、市販のサーマルサイクラー、水相もしくは気相のインキュベータ等が利用可能である。
図表1
図表2
図表3
研究内容	http://www.naro.affrc.go.jp/project/results/laboratory/fruit/2013/fruit13_s09.html
カテゴリ	育種コスト省力化データベース DNAマーカー低コスト