遺伝子定量手法による食中毒菌の損傷度評価法開発と回復培地の妥当性評価

• 担当機関: （国研）農業・食品産業技術総合研究機構 食品研究部門
• 研究期間: 2014～2016
• 研究担当者: 川崎晋; 細谷幸恵; 稲津康弘; 川本伸一; 小関成樹
• 発行年度: 2016
• 要約: 食品加工の様々な殺菌工程で発生しうる損傷菌について、その評価手法および検出法が求められている。損傷菌の損傷度を評価するため、定量PCR法による増殖遅延を指標とした評価法の開発と検出可能な水準まで迅速に増殖させる回復培地の検討を行う。
• キーワード: 損傷菌、定量PCR、増殖遅延、妥当性確認試験
• 背景・ねらい: 微生物に殺菌処理を与えた際、その多くは死滅に向かうが、処理が不十分であった場合、損傷菌の状態で生残する可能性が指摘されている。このため食品製造現場では安全性の確保を第一に過度な殺菌条件を設定している。しかし過度な殺菌は、食品の風味や食感の劣化を引き起こし、食品の嗜好性を失うことがある。本研究では、食品製造過程で行われる殺菌工程において発生しうる損傷菌の損傷度を評価できる手法を開発し、効率的な殺菌効果測定手法の提供を目指す。; さらに、損傷菌の検出には既存より優れた損傷回復用培地が必要となる。以前当研究室で開発・実用化した食中毒菌迅速検査用培地(以降、開発培地)は損傷状態のサルモネラ属菌の回復に一定の効果を認めていることから、さらにリステリアモノサイトゲネスの回復効果についても評価試験を行い、開発培地の優位性を明らかにする。

成果の内容・特徴

1. 当研究ユニットで実用化した核酸抽出キットと定量PCR法を組み合わせることで食品中における食中毒菌の遺伝子数から、特定の種類の食中毒菌の菌数を定量範囲内で推定できる。
2. 食中毒菌(ここではサルモネラ属菌)を回復培地に接種すると、健常菌は接種直後に増殖するのに対し、損傷菌は回復培地中で回復後、増殖する。この過程は1.の方法でモニタリングでき、損傷菌が回復に要する時間(遅延時間)を求めることができる。また、この遅延時間は食中毒菌が受けた損傷度の指標と考えることができる(図1)。
3. 従来の損傷菌計測は平板培養法で行われており、培地上で集落を形成できない高度損傷菌は検出できない。定量PCRを基礎とした本法は平板培養での集落計数に依存しないため、従来法では検出ができない状態の損傷菌についても評価が可能となる(図2)。
4. 本法で活用する回復培地について、AOACのガイドラインに準じて培地間比較試験を行うと、開発培地のリステリアモノサイトゲネス検出率は国際標準試験法(ISO-11290-1)で用いる従来培地と比べて有意に高く、回復効果の優位性が認められる(表1)。

成果の活用面・留意点

1. 本法による損傷度測定法は特異的遺伝子定量法であるため、例えば生乳や食肉のように雑菌や食材共雑物が存在する場合においても測定が可能である。ただし、供試食材を用い検出感度等の事前確認が必要である。
2. 現在、本法の活用範囲は加熱処理においての評価のみ行っているため、その他の食品加工処理(例えば塩蔵、酸処理など)の評価にも活用可能か、試験研究を進める必要がある。
3. 開発培地は、損傷菌の回復培地という活用だけでなく、従来のリステリア検査法の前培養培地としての活用も考えられ、検出率の向上も期待できる。
4. 開発培地の妥当性評価試験は牛挽肉を用いて行われている。概ね、多くの食品について活用可能と推測されるが、使用範囲については事前検討の必要がある。

• 研究内容: http://www.naro.affrc.go.jp/project/results/4th_laboratory/nfri/2016/nfri16_s13.html
• カテゴリ: 加工 評価法 モニタリング