新たに作出した麹菌用ジーントラップベクター

• 担当機関: （独）食品総合研究所
• 研究期間: 2001～2003
• 研究担当者: 柏木 豊; 鈴木 聡
• 発行年度: 2003
• 要約: 麹菌における網羅的遺伝子破壊株作成法及びその遺伝子破壊株の高効率選抜法を合わせて開発した。本手法を用いることにより、未知遺伝子の発見、その破壊株の取得及びその DNA 配列の取得を一度に行うことが出来る。
• キーワード: 麹菌、ポストゲノム、遺伝子機能解析、タグライン
• 背景・ねらい: 麹菌ではゲノム情報が明らかとなり、研究はポストゲノムの段階に入った。現在コンピューターによる 遺伝子機能推定が行われているが、塩基配列の相同性の情報だけでは遺伝子機能を完全に解明することは 出来ない。他生物においては、網羅的な遺伝子破壊株を収集した研究基盤が確立しており、研究者の依頼 に応じて分譲され、それぞれの遺伝子機能解析に役立てられている。麹菌においても、そのような遺伝子 破壊株の蓄積が必要であり、そのための網羅的遺伝子破壊法と、破壊株の効率的な選抜法の開発が求めら れている。
• 成果の内容・特徴: 1.麹菌における網羅的遺伝子破壊株作成法の開発のため、麹菌用ジーントラップベクターを開発した。 (図1)本ベクターはピリチアミン耐性をマーカーとし、レポーター遺伝子として緑色蛍光タンパ ク質遺伝子を保持する。; 2.本ベクターの特徴は、レポーター遺伝子の直前で切断、直鎖化した後にゲノム内にランダムに挿入し た場合、ゲノム内在遺伝子を分断破壊し、そのコード領域に正方向に挿入された場合にのみ当該内 在遺伝子のプロモーター配列を利用してレポーター遺伝子である緑色蛍光タンパク質を発現させる ものである。; 3.緑色蛍光を指標にすることにより、遺伝子破壊が成功した株のみを効率的に選抜することが可能であ る。; 4.多数の遺伝子破壊株候補を 96 穴プレート上で培養し、蛍光画像解析装置による測定を網羅的に行い、 遺伝子破壊に成功した株のみを高効率に選抜する方法を開発した。(図2); 5.本選抜法では、菌体量依存的に蛍光強度を増す赤色蛍光色素によって菌体を均一に染色することによ り、計測時菌体量を定量し、菌体量あたりの緑色蛍光強度を算出する。遺伝子破壊株は緑色蛍光タ ンパクを発現するため、菌体量あたりの緑色蛍光強度の大きい株を選抜することにより、容易に遺 伝子破壊株を得ることができる。; 6.上記の二つの手法を用いて実際に遺伝子破壊株を取得した。(図3)
• 成果の活用面・留意点: 本研究により開発された手法を用いることにより、網羅的に遺伝子を破壊した麹菌株の集団 を高効率に得ることが出来る。本手法は麹菌の機能未知遺伝子の解析に有用であり既にいくつ かの新規遺伝子について実績がある。現時点では麹菌遺伝子破壊株の情報は不十分であり、今 後、本手法を多くの麹菌研究者に利用してもらうことにより、共通の研究基盤を拡充すること が望まれる。本手法は麹菌の他、数種の糸状菌にも応用可能であり、利用を研究目的に限るこ とを条件に依頼により提供可能である。