ゲノムスキャニング法を用いたウンシュウミカン変異遺伝子の単離法

• 担当機関: 四国農業試験場
• 研究期間: 1998～1998
• 研究担当者: 清水 徳朗; 河瀬 真琴; 富岡 啓介
• 発行年度: 1998
• 要約: 本法はウンシュウミカンの枝変りや珠心胚実生由来の系統を対象として、ゲノムスキャニング法による解析で系統間で変異が認められる遺伝子を単離して構造を解析するための手法であり、栽培上有用な形質と遺伝子の関連の解析に広く活用することが出来る。
• 背景・ねらい: ウンシュウミカンには果実の熟期や糖度等の形質が微妙に異なる「枝変り」と呼ばれる体細胞の突然変異に由来する系統が多数存在している。四国農業試験場では、近年飛躍的な進歩を遂げている遺伝子解析技術を利用し、元の系統と「枝変り」系統の間で変異を生じた遺伝子を検出する手法を開発した（平成9年度成果情報）。本成果は、見出された変異遺伝子を単離する方法を開発し、その構造を解析することで果実特性の変化に関連した遺伝子の変異解析の基礎技術を提供し、果樹栽培生理機構の解明に貢献することを目的とした。

成果の内容・特徴

1. ウンシュウミカン系統間の遺伝子変異の検出はゲノムスキャニング（RLGS）法で行った。RLGS解析では全DNAを二次元電気泳動で分離するが、ゲル中の目的DNAは極微量しか存在せず、また目的外のDNAが多量に夾雑している。そこで目的DNA両末端に存在する既知の制限酵素切断部位の配列を利用し、これに相補的な配列を持つDNAを化学合成して目的DNAに付加したのち、付加したDNAの配列を利用したポリメラーゼ増幅反応（PCR）を行うことで、混在する夾雑DNAを増幅することなく目的のDNA断片のみを増幅してクローニングする手法を開発した。
2. ウンシュウミカン「宮川早生」について制限酵素NotIを用いたRLGS解析を行い、2つの遺伝子座から上記の手法を用いてそれぞれDNAをクローニングして塩基配列を決定した。得られた遺伝子座の一方は調査した10系統すべてに存在しており、タバコやイネ、マツ等の既知の葉緑体DNA一部の配列と高い相同性を示したこと、この遺伝子座が多コピーであったことや分子サイズ等から、目的とするDNAがクローニングされたと考えた。
3. もう一方の遺伝子座は、「宮川早生」には見出されるがその枝変り系統である「宮本早生」には見出されない（図1）。得られた塩基配列は既知の配列とは相同性が認められなかったが、このDNA断片をプローブとするサザンハイブリダイゼーションでは両系統間で異なるバンドが存在することが確認された（図2）。同一系統の複数の個体で同じ結果が得られたことや、分子サイズ、構造等から、目的とする系統間で変異した遺伝子座であると判断した。

• 成果の活用面・留意点: 本手法により、在来のウンシュウミカンの原系統と変異系統間で変異の認められる遺伝子を効率よく単離し、その性質を詳しく解析することが可能となる。また、他の作物についても体細胞突然変異を利用した解析に適用することが可能である。RLGS解析には放射性物質を用いるため、実施に当たっては放射性物質の実験施設が必要である。
• カテゴリ: 温州みかん たばこ