27.イネアミノ酸合成酵素の微生物における発現系の開発と除草剤化合物検索への応用

• 担当機関: 食品総合研究所
• 研究期間: 1997～1999
• 研究担当者: 伊藤 義文; 三浦裕仁; 日下部裕子; 日野明寛
• 発行年度: 1999
• 要約: アルギニン合成酵素の一つであるオルニチンカルバミルトランスフェラーゼ（OTC）のcDNA をイネから単離し、大腸菌の発現ベクターにクローン化した。大腸菌BL21(DE3)を宿主に用いた発現系で、全菌体蛋白質のほぼ10%に相当するイネOTCが生産された。DEAEカラムとSuperose; 6Bで均一に精製したイネOTCを利用した除草剤候補化合物のアッセイ系を開発した。
• 背景・ねらい: ; 農作業の一層の省力化と環境負荷の低減を達成するために、効果的で残留性の少ない非選択性除草剤の開発が求められている。この分野の研究開発は、米国が圧倒的にリードしており、国内の研究開発力の育成・促進が急務となっている。本研究は、除草剤の新規作用点を見出し、そのin vitroアッセイ系を活用した新規除草剤の開発を目的とした。
• 成果の内容・特徴: １．OTCは、植物病原菌Pseudomonas syringae pv. phaseolicolaの生産するphaseolotoxin (PTX)の特異的作用点であり、本酵素を阻害する化合物は除草剤のリード化合物となることが期待される。; ２．イネゲノムプロジェクトが単離したOTCの部分cDNAの配列をもとに、5''-RACE法で上流域をクローン化した。; ３．イネOTC cDNA をpET22b (+)にクローン化して、pOSOT10を構築した。; ４．pOSOT10を含む大腸菌BL21(DE3)をIPTG存在化で培養し、OTCを誘導した。菌体をフレンチプレスで破砕し、OTC酵素液を調製した。; ５．OTCをDEAEとSuperose 6Bのクロマトグラフィーで均一に精製した。; ６．OTCの阻害活性を評価するマイクロタイタープレートを用いたアッセイ系を構築した。
• 成果の活用面・留意点: 構築したイネOTC阻害活性のアッセイ系は、阻害化合物の検索に活用できる。
• カテゴリ: 病害虫 省力化 除草剤