牛異常産関連オルソブニヤウイルス検出のためのリアルタイムRT-PCR法の開発

• 担当機関: （国）農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究所
• 研究期間: 2013～2015
• 研究担当者: 白藤浩明; 矢崎竜; 首藤洋三; 梁瀬徹; 加藤友子; 石倉洋司; 坂口善二郎; 鈴木萌美; 山川睦
• 発行年度: 2015
• 要約: 新たに開発したリアルタイムRT-PCR法により、牛異常産に関連する各種オルソブニヤウイルスの広範な検出と主要なウイルスの特異的な検出を同時に行うことができる。また、本法は検出感度と特異性に優れ、既存のRT-PCR法より短時間で結果が得られる。
• キーワード: アルボウイルス、牛異常産、リアルタイムRT-PCR法
• 背景・ねらい: わが国では、牛の流産、死産、早産、新生子牛の体形異常といったいわゆる異常産を主徴とするアカバネ病、アイノウイルス感染症、チュウザン病等の節足動物媒介性(アルボ)ウイルス感染症が牛の生産阻害要因となっている。各種アルボウイルスの中で、届出伝染病の病原体であるアカバネウイルス(Akabane virus:AKAV)やアイノウイルス(Aino virus:AINOV)が含まれる牛異常産関連オルソブニヤウイルスの検査では、ウイルス分離や抗体検査と並行してRT-PCR法によるウイルス遺伝子の検査を行うのが一般的であるが、特に異常産が多発し検査量が増えた場合、RT-PCR法は長時間の作業を要して利用が困難である。また、ウイルスゲノムの変異や新興ウイルスの出現により、既存の方法では近年の分離ウイルス株に対して検出感度が低い例がある。そこで本研究では、わが国で分離される牛異常産関連オルソブニヤウイルスを短時間で高感度に検出可能なリアルタイムRT-PCR法を確立する。

成果の内容・特徴

1. 本法では、AKAVやAINOVのほか、牛異常産発生との関与が多数報告されているピートンウイルス(Peaton virus:PEAV)や、わが国で分離されているサシュペリウイルス(Sathuperi virus:SATV)やシャモンダウイルス(Shamonda virus:SHAV)等の牛異常産関連オルソブニヤウイルスに共通な塩基配列を標的としたプライマー・プローブセット(Pan-Simbu1セット)を用いる。加えて、AKAV、AINOV、PEAVについては、各ウイルスに特異的なプライマー・プローブセット(AKAV、AINOV、PEAV特異的セット)を用いる。なお、各プローブを異なるレポーター色素(FAM、HEX)で標識し、クエンチャー色素としてBHQを用いることで、1つのチューブに2組のプライマー・プローブセットを混和して使用し、2つの標的を個別に検出することが可能である(図1)。
2. 既存のRT-PCR法では反応開始から結果の確認まで4時間以上を要するのに対し、本法では反応開始からおよそ2時間で結果が得られる。
3. わが国で1959～2013年に分離された計44株の各種アルボウイルスを供試すると、いずれのプライマー・プローブセットも標的ウイルスの遺伝子が特異的に検出される。一方、健常牛由来材料(アルボウイルス非感染、計28検体)ではいずれも陰性となる。
4. 各プライマー・プローブセットの1反応当りの検出限界は1～100コピーであり、いずれも既存のRT-PCR法と同等以上の検出感度を有する。また、2012年にアカバネ病の発症および疑い例で採取された牛由来材料(計60検体)を供試すると、既存のRT-PCR法により陽性と判定された30検体に加えて、陰性と判定された2検体からもAKAV遺伝子が検出される。

• 成果の活用面・留意点: 前述のPan-Simbu1セットを用いることで、牛異常産関連オルソブニヤウイルスの国内分離株に加えて、欧州で分離されたシュマレンベルクウイルスも検出可能である。
• 研究内容: http://www.naro.affrc.go.jp/project/results/laboratory/niah/2015/niah15_s26.html