ゲノム編集技術CRISPR/Cas9法により作成したブドウのアルビノ変異体

• 担当機関: （国研）農業・食品産業技術総合研究機構 果樹茶業研究部門
• 研究期間: 2014～2017
• 研究担当者: 中島育子; 伴雄介; 東暁史; 尾上典之; 森口卓哉; 山本俊哉; 土岐精一; 遠藤真咲
• 発行年度: 2017
• 要約: ゲノム編集技術CRISPR/Cas9法によりブドウでフィトエンデサチュラーゼ遺伝子の機能破壊により、アルビノ変異型の個体が効率的に獲得できることから、ブドウの有用形質に関わる様々な遺伝子の機能解明に役立つことが期待できる。
• キーワード: ゲノム編集、ブドウ、CRISPR/Cas9
• 背景・ねらい: 近年、CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集により、様々な生物で狙った遺伝子に変異を導入する技術が発展してきた。CRISPR/Cas9はCas9ヌクレアーゼとそれをゲノムの標的にガイドするガイドRNAによって、ゲノムDNAの狙った部位を切断し、その部位でのDNA修復ミスによって変異を起こす技術である。これまで、シロイヌナズナ、イネ、トマト、ポプラなどでゲノム編集が可能であることが示されてきており、果樹ではリンゴおよびカンキツでゲノム編集の報告がある。本研究ではブドウにおけるゲノム編集の技術開発に向けて、アルビノ変異型を指標にCRISPR/Cas9法によるゲノム編集技術の有効性を評価する。

成果の内容・特徴

1. ブドウにおける植物のカロテノイド生合成に関わるフィトエンデサチュラーゼ遺伝子(PDS遺伝子)について、PAM配列の直前に制限酵素サイトを持ち、CAPS解析により変異導入の確認できるガイド配列候補4つについてin vitro cleavage assayで切断効率を判断する。切断効率が高いと判断されたガイド配列2種類をCRISPR/Cas9により切断する部位として選び、それぞれの配列にあったベクターを構築する。
2. ブドウ品種「ネオマスカット」(Vitis vinifera L.)へ、アグロバクテリウム法によりエンブリオジェニックカルスへ上記2種類のベクターをそれぞれ導入し、組織培養によって植物体を再生させると、図1のような斑入り植物体が得られる。
3. 斑入りになった葉のPDS遺伝子の標的とした領域をシークエンスすると、一枚の葉の中に数種類の変異が認められる(図2)。
4. いずれのベクターでも狙った部位に変異が導入され、変異導入効率は若い葉よりも古い葉の方が高い傾向にある。また、本来のターゲットに類似した異なる配列に変異が誘発されるオフターゲット変異については、オフターゲットになる可能性の最も高い配列をCRISPR-P programを用いて選び出す。2種類のガイドに対してオンターゲットの変異率が最も高かった葉のDNAを用いてオフターゲット候補のシークエンスを読んだところ、変異は認められない。

成果の活用面・留意点

1. 本研究において確立できたブドウゲノム編集技術は、ブドウの有用形質に関わる様々な遺伝子の機能解明につながる。得られたゲノム編集個体はキメラであるため、キメラ解除の検討が必要である。
2. 本研究では遺伝子組換え個体を作成してゲノム編集を誘発したが、一度編集が誘発された後は外来遺伝子が不要となることから、外来遺伝子を除去する方法あるいは遺伝子を導入しないでゲノム編集を行う方法の開発も必要である。

• 研究内容: http://www.naro.affrc.go.jp/project/results/4th_laboratory/nifts/2017/nifts17_s17.html
• カテゴリ: トマト 品種 ぶどう りんご その他のかんきつ